技術(shù)文章
TECHNICAL ARTICLES重組蛋白的表達(dá)技術(shù)涵蓋了從基因克隆到蛋白純化等多個環(huán)節(jié),主要包括以下幾類技術(shù):
基因克隆與載體構(gòu)建:在這一步驟中,目標(biāo)蛋白的基因序列被克隆到合適的表達(dá)載體中,這些載體通常包含有抗生素抗性基因、啟動子、以及用于蛋白純化的標(biāo)簽序列等。例如,可以使用pET系列載體在大腸桿菌中表達(dá)目標(biāo)蛋白 。
原核表達(dá)系統(tǒng):原核表達(dá)系統(tǒng),如大腸桿菌(Escherichia coli),是常見的表達(dá)系統(tǒng)。它基于T7 RNA聚合酶及其強(qiáng)啟動子之間的特異性和轉(zhuǎn)錄的高效性建立的pET系統(tǒng)是
常用的E. coli表達(dá)系統(tǒng) 。
真核表達(dá)系統(tǒng):包括酵母、昆蟲/桿狀病毒以及哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。這些系統(tǒng)能夠提供更接近天然狀態(tài)的蛋白,包括正確的折疊和翻譯后修飾 。
密碼子優(yōu)化:根據(jù)表達(dá)系統(tǒng)對密碼子的偏好性進(jìn)行優(yōu)化,提高mRNA二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和新生肽段的正確折疊,從而提高外源活性蛋白的表達(dá) 。
表達(dá)條件優(yōu)化:包括培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基組成、誘導(dǎo)條件等,這些因素都會影響蛋白的可溶性和表達(dá)量 。
蛋白純化技術(shù):利用親和層析、離子交換層析、凝膠過濾層析等技術(shù)對表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化,以獲得高純度的重組蛋白 。
質(zhì)量控制:對純化后的蛋白進(jìn)行生物活性檢測、純度分析和內(nèi)毒素水平檢測等,確保蛋白的質(zhì)量和安全性 。
規(guī)模放大:在實(shí)驗(yàn)室條件下成功表達(dá)和純化蛋白后,需要將生產(chǎn)過程放大到工業(yè)規(guī)模,以滿足商業(yè)化的需求 。
分子伴侶或折疊酶共表達(dá):通過共表達(dá)分子伴侶或折疊酶幫助目標(biāo)蛋白正確折疊,增加可溶性蛋白的表達(dá)量 。
細(xì)胞自由表達(dá)系統(tǒng):這是一種在無細(xì)胞體系中進(jìn)行蛋白表達(dá)的方法,可用于快速生產(chǎn)蛋白,特別是難以在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的膜蛋白或毒素蛋白 。
這些技術(shù)的選擇和應(yīng)用取決于目標(biāo)蛋白的特性、所需的蛋白量、以及是否需要特定的翻譯后修飾等因素。通過這些技術(shù)的組合使用,可以實(shí)現(xiàn)高效、高產(chǎn)量的重組蛋白生產(chǎn)。
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