抗體是機體在抗原刺激下產(chǎn)生的能與該抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白。常規(guī)的抗體制備是通過動物免疫并采集抗血清的方法產(chǎn)生的,因而抗血清通常含有針對其他無關(guān)抗原的抗體和血清中其他蛋白質(zhì)成分。一般的抗原分子大多含有多個不同的抗原決定簇,所以常規(guī)抗體也是針對多個不同抗原決定簇抗體的混合物。即使是針對同一抗原決定簇的常規(guī)血清抗體,仍是由不同B細胞克隆產(chǎn)生的異質(zhì)的抗體組成。
單抗制備的生產(chǎn)及純化方法:
(1)動物體內(nèi)生產(chǎn)單抗
?、俪赡闎ALB/c小鼠腹腔接種降植烷或液體石蠟,每只小鼠0.3-0.5ml。
②7-10天后腹腔接種用PBS或無血清培養(yǎng)基稀釋的雜交瘤細胞,每只小鼠5×105/0.2ml。
?、坶g隔5天后,每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況,如腹部明顯膨大,以手觸摸時,皮膚有緊張感,即可采集腹水。通常每只小鼠可采3ml腹水。
?、軐⒏顾x心(2000r/min5分鐘),除去細胞成分和其他的沉淀物,收集上清,測定抗體效價,分裝,70℃凍存?zhèn)溆谩?br />
(2)單克隆抗體的純化(辛酸-硫酸銨沉淀法)
?、俑顾?℃12000rpm離心15min,去除雜質(zhì)。
②取1份腹水加2份0.06mol/LPH5.0醋酸緩沖液,按每毫升稀釋腹水加33ul辛酸的比例,室溫攪拌下逐滴加入辛酸,室溫混合30min。
?、?℃靜置2小時,取出12000g離心30分鐘,棄沉淀。
?、苌锨褰?jīng)尼龍篩過濾,于50倍體積的0.01MPH7.4PBS中4℃透析6h。
?、菰谕肝龊蟮纳锨逯屑尤氲润w積飽和硫酸銨溶液。
⑥4℃靜置1h以上,10000g離心30分鐘,棄上清。
?、叱恋砣苡谶m量PBS(含137mmol/LNaCl,2.6mol/LKCl,0.2mmol/L EDTA)中,于50-100倍體積的PBS中透析過夜。
?、嗳∩倭客肝龊髽悠愤m當(dāng)稀釋后,以紫外分光光度計檢測蛋白含量,SDS-PAGE,抗體純度。