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有助于提高蛋白表達目的的實驗方案

更新時間:2022-01-19點擊次數(shù):1260
  克隆基因在細(xì)胞中表達對理論研究和實驗應(yīng)用都具有重要的意義。通過表達能探索和研究基因的功能以及基因表達調(diào)控的機理,同時克隆基因表達出所編碼的蛋白質(zhì)可供作結(jié)構(gòu)與功能的研究。大腸桿菌是目前應(yīng)用廣泛的蛋白表達系統(tǒng),其表達外源基因產(chǎn)物的水平遠高于其它基因表達系統(tǒng),表達的目的蛋白量甚至能超過細(xì)菌總蛋白量的80%。本實驗中,攜帶有目標(biāo)蛋白基因的質(zhì)粒在大腸桿菌BlL21中,在37℃,IPTG誘導(dǎo)下,超量表達攜帶有6個連續(xù)組氨酸殘基的重組氯霉素?;D(zhuǎn)移酶蛋白,該蛋白可用一種通過共價偶連的次氨基三乙酸(NTA)使鎳離子(Ni2+)固相化的層析介質(zhì)加以提純,實為金屬熬合親和層析(MCAC)。蛋白質(zhì)的純化程度可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析。
  有助于提高蛋白表達目的的實驗方案:
  1.降低蛋白合成的速度。可以通過以下方法實現(xiàn):
  a.降低培養(yǎng)溫度b.使用弱啟動子。
  c.使用低拷貝數(shù)的質(zhì)粒表達載體d.降低誘導(dǎo)物的濃度。
  e.在比較高的菌密度進行較短的時間誘導(dǎo)。
  2.改變培養(yǎng)基。
  a.培養(yǎng)基中加入可以幫助蛋白折疊的因子。
  b.加入緩沖液保持pH穩(wěn)定c.加入1%的葡萄糖,抑制lac啟動子。
  d.加入山梨糖醇等可以穩(wěn)定蛋白天然結(jié)構(gòu)的因子。
  e.加入乙醇,thiols and disulfides等。
  3.分泌表達。使目的蛋白分泌到周質(zhì)空間。
  周質(zhì)空間的氧化性的環(huán)境有利于二硫鍵的形成,而胞內(nèi)則是還原性的。周質(zhì)空間有折疊酶DsbA和DsbC的存在,幫助蛋白正確折疊。
  周質(zhì)空間很少有蛋白酶存在,不會被水解。
  可以使對細(xì)胞有毒性的蛋白大量存在。
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